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小鼠鈣結合蛋白(CR)elisa試劑盒操作步驟

 更新時(shí)間:2024-05-31 點(diǎn)擊量:1143

小鼠鈣結合蛋白(CR)elisa試劑盒操作步驟操作步驟

小鼠鈣結合蛋白(CR)elisa試劑盒實(shí)驗原理

小鼠鈣結合蛋白(CR)ELISA試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被小鼠鈣結合蛋白(CR)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經(jīng)過(guò)溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠鈣結合蛋白(CR)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長(cháng)下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。

樣本處理及要求

1.  血清:將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。
2.  血漿:EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。
3. 組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會(huì )影響測量結果),稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

4. 細胞培養物上清或其它生物標本:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

注:標本溶血會(huì )影響最后檢測結果,因此溶血標本不宜進(jìn)行此項檢測。

需要而未提供的試劑盒器材

1.酶標儀(450nm

2.高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL2-20uL20-200uL200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

名稱(chēng)

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標板

8×12

8×6

無(wú)

標準品

0.3mL*6

0.3mL*6

無(wú)

樣本稀釋液

6mL

3mL

無(wú)

檢測抗體-HRP

10mL

5mL

無(wú)

20×洗滌緩沖液

25mL

15mL

按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋

底物A

6mL

3mL

無(wú)

底物B

6mL

3mL

無(wú)

終止液

6mL

3mL

無(wú)

封板膜

2

2

無(wú)

說(shuō)明書(shū)

1

1

無(wú)

自封袋

1個(gè)

1個(gè)

無(wú)

 

備注

1、標準品濃度依次為:詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū);

2、經(jīng)過(guò)大量正常標本檢驗,標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內,實(shí)驗過(guò)程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過(guò)最大標準品濃度時(shí),可用樣本稀釋液將標本進(jìn)行適當稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗。
小鼠鈣結合蛋白(CR)elisa試劑盒操作步驟

注意事項

1、嚴格按照規定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2、洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。

3、消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。

4、底物顯色液應呈無(wú)色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

5、避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

6、在儲存和溫育時(shí)避免強光直接照射。

7、平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8、任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會(huì )破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9、不能使用過(guò)期產(chǎn)品。

10、如果可能傳播疾病,所有的樣品都應管理好,按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。

2洗滌緩沖液的稀釋?zhuān)赫麴s水按120稀釋?zhuān)?/span>120×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃

2. 設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL

3.樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加。

4. 除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min

5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿(mǎn)洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。

6.每孔加入底物AB50μL37℃避光孵育15min

7.每孔加入終止液50μL15min內,在450nm波長(cháng)處測定各孔的OD值。

實(shí)驗結果計算

以所測標準品的OD值為橫坐標,標準品的濃度值為縱坐標,在坐標紙上或用相關(guān)軟件繪制標準曲線(xiàn),并得到直線(xiàn)回歸方程,將樣品的OD值代入方程,計算出樣品的濃度。

試劑盒性能

1、檢測范圍:詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

2、靈敏度:詳情見(jiàn)說(shuō)明書(shū)

3、特異性:不與其它可溶性結構類(lèi)似物交叉反應。

4、重復性:板內變異系數小于10% ,板間變異系數小于15% 。